前言
2021年7月，内蒙古医科大学在Frontiers In Immunology期刊发表的题为“Kaempferol Alleviates Murine Experimental Colitis by Restoring Gut Microbiota and Inhibiting the LPS-TLR4-NF-kB Axis ”的研究成果，通过16S rRNA基因测序和GC-MS非靶向代谢组学研究方法，探究了山奈酚抗溃疡性结肠炎的潜在机制。
中文标题：山奈酚通过恢复肠道微生物群和抑制 LPS-TLR4-NF-kB 信号通路来缓解小鼠实验性结肠炎
研究对象：小鼠结肠、粪便、血液
发表期刊：Frontiers In Immunology
影响因子：7.561
发表时间：2021年7月
合作单位：内蒙古医科大学
运用生物技术：16S rRNA基因测序、GC-MS 非靶向代谢组学
研究背景
溃疡性结肠炎（UC）是最常见的炎症性肠病（IBD），其特点是预后不良，症状复发，有可能发展为结肠炎相关癌症，因此得到广泛关注。它与肠粘膜屏障功能缺陷有关，且特征之一是肠道微生物失调，因此调节肠道微生物群是一种可能的治疗策略。山奈酚（Kae）是一种从多种药用植物中提取的抗炎和抗氧化类黄酮，具有治疗溃疡性结肠炎的潜在功效，但其治疗效果以及与肠道微生物群之间的联系机制尚未被完全了解。本文作者将山奈酚作为治疗溃疡性结肠炎的药物，用于葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠，以考察其治疗效果并通过调节肠道微生物菌群和影响TLR4相关信号通路的潜在作用机制。
研究思路
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研究方法
·实验分组：6周龄C57BL/6J小鼠，分为四组（对照组NC，山奈酚对照组Kae、诱导结肠炎组DSS和山奈酚治疗组DSS-Kae），每组10只。
·评估结肠炎程度：依据疾病评估指数及组织病理学结果
·检测促炎因子水平：酶联免疫吸附测定、定量逆转录聚合酶链式反应
·组学检测：16S rRNA基因测序、GC-MS非靶向代谢组学、免疫组织化学、肠道通透性的测量
研究结果
1.山奈酚可以减弱 DSS 诱导的小鼠结肠炎和触发的促炎反应
结肠炎症评估结果显示，DSS会引起小鼠严重的肠粘膜损伤（图1），但口服Kae补充剂会减轻肠炎症状，因此山奈酚可以减轻DSS诱导的小鼠结肠炎的症状，减轻结肠损伤。
与对照组相比，DSS处理组结果表明，DSS引起血清中IL-1、IL-6和TNF-a水平显著升高。但添加Kae，可以显著逆转升高趋势（图2A-C）。DSS处理组可以显著增加炎症因子（如IL-1b、IL-6、TNF-a、COX-2、MCP-1和iNOS）的mRNA水平表达，同时抑制IL-10的表达（P
此外，DSS组模式识别受体TLR4和NLRP3以及信号分子MAPK1和NF-kB的mRNA表达水平也升高。但服用Kae会强烈抑制结肠炎相关基因的转录，同时逆转DSS对IL-10转录的影响。因此可以得知，Kae可能通过上调IL-10转录和下调炎症相关基因的表达，减轻了UC引起的炎症。
图1 | 山奈酚减轻了 DSS 诱导的小鼠结肠炎的症状
图2 | 山奈酚对 DSS 和 Kae 治疗小鼠组的炎症相关细胞因子水平的影响
2.山奈酚可预防肠屏障丧失完整性
为评估 Kae 给药对肠屏障完整性的保护作用，测量了摄入的 FITC-葡聚糖的荧光光谱，并使用 qRT-PCR和免疫组织化学进行了紧密连接 (TJ) 基因表达水平的检测。结果表明，与仅服用DSS小鼠相比，Kae处理组的肠道通透性有所改善（图3A）。DSS处理导致ZO-1、occludin 和 claudin-1 表达水平降低，而在Kae处理的小鼠中，它们的表达与未处理的对照小鼠相似（图 3B-E）。这些数据表明，Kae 通过维持肠道屏障完整起到抗炎作用。
图3 | Kae可改善肠道通透性并增强肠道紧密连接蛋白的表达
3.山奈酚可重塑肠道微生物群的多样性和丰富性
作者还通过16S rRNA基因高通量测序，揭示 Kae对肠道微生物群的影响。
实验结果表明NC组的肠道微生物群组成与DSS组不同。聚类结果表明，DSS-Kae组位于与DSS组不同分支上，且靠近NC和Kae组（图4E-G），表明服用Kae可维持小鼠的肠道微生物群落结构。
如图5A所示，DSS处理会导致拟杆菌门和厚壁菌门菌群的丰度明显下降，而变形菌门的丰度增加。但服用Kae 可防止厚壁菌门/拟杆菌门比率的降低（图 5B）。LEfSe 分析也显示，DSS 组中的致病菌的 LDA 评分大于4。但DSS-Kae组的有益菌得分较高（图 5C和D）。
图4 | 服用Kae可增加DSS处理后小鼠的肠道微生物群的多样性和丰富度
图5 | 山奈酚对肠道菌群分布的影响
4.山奈酚Kae 对肠道微生物群相关代谢物起到调节作用
使用GC-MS非靶向代谢组学研究 Kae 补充剂对结肠炎小鼠粪便代谢特征的影响。PLS-DA 和 OPLS-DA分析显示，DSS和DSS-Kae 组小鼠的代谢特征明显不同（图6A和B），鉴定出14种在DSS 和DSS-Kae组之间丰度差异显著的代谢物。服用Kae 可大大增加 DSS 处理的小鼠 D-果糖 2,6-二磷酸、D-木糖、半乳糖醇、乳糖和 N-乙酰-5-羟色胺的表达水平（图6C）。
通路富集分析表明，Kae 引起了与苯丙氨酸代谢、半乳糖代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢相关的代谢途径的重大改变（图6D）。结果表明 Kae 对 UC的保护作用与微生物代谢物的调节有关。
图6 | Kae改变了粪便代谢成分
5、山奈酚可抑制 LPS-TLR4-NF-kB 炎症通路的表达
DSS组小鼠血清中的 LPS 含量显著增加，表明 DSS 引发了代谢性内毒素血症（图7A）。但DSS-Kae 组的LPS 水平显著降低，表明 Kae 能够缓解 DSS 诱导的内毒素血症。免疫组织化学分析显示 Kae 抑制了DSS诱导的 TLR4、MyD88、p-NF-kB-P65 和 NLRP3 的表达（图7B）。因此Kae 的抗结肠炎活性可部分归因于LPS-TLR4-NF-kBinflammatory通路的抑制。
图7 | Kae抑制LPS-TLR4-NF-kB 信号通路
6、山奈酚的抗结肠炎作用可能是由微生物群转移引起的
为了进一步评估肠道微生物群及其代谢产物在Kae的抗炎中的作用，进行了FMT和共同住房实验（图8A）。结果表明，FMT显著增加了DSS-Kae小鼠和DSS小鼠的结肠长度，降低了DAI评分，并减轻了病理特征（图 8B-F）。此外移植组血清的 IL-1b、IL-6、TNF-a 和 LPS 含量也降低（P
图8 | 响应 Kae 改变的微生物群移植概括了 Kae 治疗对 DSS 诱导的结肠炎的影响
相关讨论
很多研究表明，肠道微生物群多样性和丰富度的下降与结肠炎患病率的增加相关，UC患者中厚壁菌门与拟杆菌门的比率 (F/B) 下降，而变形菌门的丰度显着增加，这也是肠道菌群失调的标志性特征。作者的研究发现，Kae 可以逆转 DSS 治疗小鼠的 F/B 比率。Kae 处理组通过降低变形菌的丰度来重塑微生物群的组成，同时一些益生菌例如 Prevotellaceae 和 Ruminococcaceae 门增加。
在消化过程中，肠道微生物群会产生大量代谢物。这些代谢物与肠上皮细胞相互作用，可进入循环系统，并在人类健康和疾病中发挥重要作用。有文献表明本实验发现的差异代谢物半乳糖代谢与维持细胞的能量摄入有关，而苯丙氨酸、精氨酸和脯氨酸的代谢与多种人类疾病密切相关。
用 FMT作者进一步证明了肠道菌群在调节 Kae 对 UC 小鼠的影响方面起着关键作用。肠道微生物的粪口移植的数据表明 Kae 的抗结肠炎作用可以在共同饲养的小鼠之间转移，意味着肠道微生物群参与了Kae的作用机制。
微生物16S rRNA 基因的测序表明，变形菌在研究的过程中变形菌起着关键作用。TLR4 是变形菌释放的LPS 的特异性受体。本研究表明Kae可通过抑制 DSS 引发的结肠炎小鼠中LPS-TLR4-NF-kB 信号传导的激活来抑制炎症相关介质的表达。
肠黏膜屏障的破坏是结肠炎原因之一，可导致肠道通透性升高，抗原、毒素和病原体从腔内环境渗入黏膜组织，导致炎症发作。作者发现与 DSS组相比，Kae-DDS组的肠道通透性降低。作者还证明 Kae 可以显著恢复小鼠结肠炎模型中 ZO-1、occludin 和 claudin-1表达，可能恢复肠粘膜屏障的完整性。
图9 | Kae 通过与 LPS-TLR4-NF-kB 核心途径相关的肠道微生物群途径发挥出色的抗UC作用
研究讨论
肠道菌群失调与包括溃疡性结肠炎UC在内的多种病理过程有关。了解这种关系对于充分利用微生物干预在临床治疗中的治疗潜力至关重要。本文发现Kae 通过调节肠道微生物群和多种代谢物在UC小鼠中发挥免疫调节作用，从而抑制LPS诱导的 TLR4-NF-kB 信号传导。该研究结果证明了Kae的抗UC作用及其潜在的治疗机制，并为使用天然产品预防炎症性疾病提供了新的见解。
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本文是一篇非常典型的中研究药有效成分治疗疾病的机制文章，作者的实验分组非常合理，并通过FMF（粪便移植）和同笼实验，验证了肠道菌群在疾病治疗中发挥的重要作用。16S rRNA基因测序和GC-MS 非靶向代谢组学双平台的运用，结合免疫组化的实验结果，比较完整地阐释了山奈酚治疗溃疡性结肠炎的潜在机制，对于治疗溃疡性结肠炎提供了新的思路。同时，这篇文章简单明了的实验思路，也可为相关研究的老师们提供参考。
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