研究背景
根瘤菌和丛枝菌根真菌（AMF）是重要的共生微生物，对生长在金属污染土壤中的植物有利。然而，目前仍不清楚接种的微生物如何影响根际微生物群落，或者根际微生物群落的后续变化是否有助于提高金属胁迫下的植物抗性。
研究目的
研究接种根瘤菌和AMF对苜蓿抗镉（Cd）胁迫的影响，利用16S和ITS rRNA基因的高通量测序，进一步分析了根际微生物群落接种后的响应及其在提高紫花苜蓿抗性方面的作用。
技术路线
研究结果
1、根际土壤理化性质
根据双因素方差分析的结果，Cd、接种处理及其相互作用对NO3--N， NH4 +-N ，SOC和AP含量有显著影响（P
2、植物的物理化学性质和植物组织对Cd的吸收情况
添加Cd和接种根瘤菌以及AMF都显著影响紫花苜蓿生物量，包括芽和根(P＜0.01；表1)。此外，接种处理大大提高了紫花苜蓿的芽和根生物量，而添加Cd则显著降低了紫花苜蓿的芽和根生物量（P＜0.01）。例如，在添加Cd的根瘤菌和AMF共同接种的处理中，紫花苜蓿生物量最高（3.35±0.116 g /pot）。此外，紫花苜蓿芽和根中的Cd浓度显著受Cd添加、接种及其相互作用的影响。接种和Cd处理大大增加了紫花苜蓿芽和根的Cd吸收含量（表1）。与对照(未接种)相比，所有接种处理下根中的Cd含量均高于芽中的Cd含量(P
接种后，芽和根的抗氧化能力明显增强，其中AR、AM和ARM处理的SOD、CAT和POD活性均显著高于A处理（P＜0.05；表2）。与未接种和单独接种处理相比，根瘤菌和AMF共同接种处理中紫花苜蓿的SOD、CAT和POD活性最高。例如，在ARM处理中，芽的SOD活性比A处理大1.4倍。AR、AM和ARM处理中芽的MDA含量明显低于A处理(分别降低27.28%、21.81%和34.09%)(P＜0.05；表2)。此外，与对照未接种植物相比，共同接种处理中MDA、H2O2和O2-含量最低。
表1 生物量、Cd含量和植物组织对Cd的吸收。
表2 不同处理中植物芽的丙二醛(MDA)、活性氧(O2-，H2O2)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD))含量。
3、根际微生物群落的α多样性
所有土壤样品共鉴定出4847280条高质量的微生物序列，其中真菌序列2593280条，细菌序列2254000条，在97%的相似度截止水平下，可分别聚类为904和197个OTU。对于细菌群落来说，OTU、ACE、Chao1、Simpson和Shannon-Wiener指数均受到Cd添加、接种及其相互作用的显著影响(P＜0.05；图1)。特别是在接种处理下，Cd的添加大大降低了细菌Simpson多样性指数。在添加Cd的情况下，接种显著降低了细菌Simpson多样性指数，而在对照处理中则增加了细菌Simpson多样性指数。对于真菌群落来说，Cd的添加、接种以及它们之间的相互作用对Chao1和Simpson多样性指数都有明显的影响。特别是在所有接种处理下，Cd的添加都显著提高了真菌的Simpson多样性指数（P＜0.05；图1）。接种与添加Cd处理和对照处理都能显著提高真菌的Simpson多样性指数。添加Cd处理和对照处理，接种后均可显著提高真菌的Simpson多样性指数。
图1 不同处理之间细菌（A，B），真菌（C，D）α多样性的差异。
4、根际微生物群落的结构
我们的研究在所有不同的处理中检测到了10个细菌门类(相对丰度>1%)，即变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、蓝藻细菌门（Cyanobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）(图2A)。相对丰度Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria和Firmicutes是主要的细菌门。Cd添加、接种及其相互作用显著影响了Firmicutes、Bacteroidetes和Acidobacteria的相对丰度。特别是Cd的添加，明显降低了所有接种(AR、AM和ARM)处理中Actinobacteria的相对丰度，而增加了两个接种(AM和ARM)处理中Firmicutes的相对丰度。
我们的研究在所有不同的处理中检测到了10个真菌门类(相对丰度>1%)，即子囊菌门（Ascomycota）、Unclassified、担子菌门（Basidiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、毛霉门（Mucoromycota）、尾虫门（Cercozoa）、油壶菌门（Olpidiomycota）和罗兹菌门（Rozellomycota）(图2B)。在所有处理中，占主导地位的真菌门为Ascomycota（44.3-65.7%）和Unclassified（14.9-36.6%）。Cd的添加显著影响了Cercozoa和Rozellomycota的相对丰度，接种后极大地影响了Glomeromycota、Mortierellomycota和Rozellomycota的相对丰度(P Basidiomycota和Glomeromycota。同时，对指示菌种的分析表明，从门到科水平的这些细菌类群(Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Firmicutes)和真菌类群(Glomeromycota、Mortierellomycota和Rozellomycota)都是根瘤菌和AMF共同接种后根际微生物群落的主要指标(表3)。
双因素方差分析表明，添加Cd、接种及其相互作用极显著地影响了细菌和真菌的群落结构(P＜0.001)。此外，NMDS和ANOSIM分析表明，真菌和细菌群落结构在Cd和接种处理中均有显著差异(P＜0.001；图3)。部分Mantel检验进一步证实，添加Cd和接种处理与真菌和细菌群落内的异质性都有很大的相关性。
图2 不同处理中主要细菌（A）和真菌（B）类群的相对丰度。
表3 通过添加Cd处理后的指示性类群分析，在门类水平将分类群确定为根际潜在指标。
图3 从Bray-Curtis距离矩阵得出的非度量多维标度（NMDS）排序图。
5、微生物群落与土壤特性的关系
Pearson相关分析发现，Cd、OTU和细菌群落的α多样性指数(即Shannon、Simpson、Chao1和ACE)之间存在显著的相关性(P＜0.05)。除Shannon指数外，SOC、TN、SOC:TN和SOC:TP与OUT以及细菌群落中的这些α多样性指数之间存在显著的相关性。但是，除了真菌群落的OTU和Shannon与SOC和SOC:TN外，真菌群落的α多样性指数与这些土壤性质之间没有发现明显的相关性。
VPA的结果表明，土壤性质和Cd含量一般能解释细菌群落的大部分变化（62.8%），而它们只能解释真菌群落12.9%的变化（图4A和B）。Mantel检验和相关分析表明，除TP和SOC:TP外，其他土壤变量均与细菌群落显著相关，而只有Olsen-P和pH值对真菌群落有显著影响（图4C）。此外，RDA还证实，与不同处理的真菌群落相比，土壤变量对不同处理的细菌群落有更明显的影响。根据相关性热图和RDA或CCA，细菌群落中的Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Acidobacteria和Chloroflexi与除TP外的其他土壤变量显著相关(P＜0.05；图4D)。然而，在真菌群落中，只有Chytridiomycota、Olpidiomycota和Rozellomycota与大多数土壤变量表现出明显的相关性(P
图4 变异分区分析显示了细菌（A）和真菌（B）群落解释的土壤特性和土壤Cd的差异百分比。土壤变量与微生物群落结构之间的关系（C）。细菌类群（门水平，D）和真菌类群（门水平，E）与土壤特性的相关热图。
6、接种和添加Cd处理与微生物群落、土壤特性、植物生物量和Cd吸收的级联关系
PLS-PM表明，接种根瘤菌和ARM直接影响真菌和细菌多样性，间接影响抗氧化酶活性、脂质过氧化和苜蓿生物量。接种对细菌多样性（OTU、ACE、Chao-1、Simpson和Shannon指标）有正向影响，但对真菌多样性无显著影响。接种正向影响抗氧化酶活性和苜蓿生物量，负向影响脂质过氧化（图5D）。接种对抗氧化酶活性（0.60）和植物生物量（0.55）的影响最大。
图5 处理（接种和添加Cd）与微生物群落、土壤特性和植物抗性的级联关系。偏最小二乘路径模型(PLS-PM)剖析了处理、微生物群落和土壤特性对植物抗性的主要影响途径(A)(B)；以及每个变量对植物生物量、抗氧化酶和脂质过氧化物的总影响(C)(D)。
讨 论
1、根瘤菌与AMF共接种对Cd胁迫下植物抗性的影响
本研究发现，苜蓿生长4个月后生物量明显增加，根瘤菌和AMF处理的生物量最高（表1）。与未接种的处理相比，使用根瘤菌或AMF的单次接种处理伴随着生物量的增加和营养物质的获得。有的研究表明，接种AMF增加了豆科植物的根瘤数量，这表明菌根的形成提供了足够的磷（P）来支持根瘤和类杆菌的生长。在所有接种处理中，根瘤菌和AMF共接种处理对缓解苜蓿Cd胁迫的总体效果最大。
补救策略的可行性在很大程度上取决于土壤中残留重金属的生物活性及其在植物中的利用率。根瘤菌和AMF共同接种处理中，紫花苜蓿芽和根的Cd吸收总量明显高于单独接种或未接种处理（表1）。苜蓿芽中的Cd浓度保持稳定，说明接种可防止Cd在植物组织中过量积累，同时可以促进植物生物量的增加（表1）。此外，Cd主要积累在根部，转移到芽上的Cd量极少，这阻碍了芽上出现的Cd诱导的中毒症状的发生，从而有利于植物稳定。
2、根瘤菌与AMF共接种对Cd胁迫下植物抗性的影响
探究根瘤菌与AMF共接种提高植物抗病性的途径是揭示接种促进生长机制的关键。在我们的研究中，接种微生物显著增加了Cd胁迫下紫花苜蓿根际细菌多样性，降低了真菌多样性，说明共接种有利于细菌群落多样性的恢复；而添加Cd则不利于真菌群落多样性的恢复（图1）。群落多样性反映了群落的稳定性和功能多样性，因此，与真菌群落相比，细菌群落对苜蓿抗Cd胁迫的辅助潜力更大。此外，PLS-PM还确定了Cd胁迫下细菌多样性对抗氧化酶活性和苜蓿生物量的显著正相关关系（图5）。
对于真菌类群，在AMF接种后，Glomeromycota的相对丰度显著增加（AMF属于Glomeromycota）（图2B）。另一方面，Mortierellomycota和Rozellomycota相对丰度的下降可能是由于Glomeromycota相对丰度的增加所致（图S1B）。因此，在根瘤菌和AMF共同接种后，这些细菌类群（增加的类群包括Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi，减少的类群包括Bacteroidetes和Firmicutes）和真菌类群（增加的分类群包括Glomeromycota，减少的分类群包括Mortierellomycota和Rozellomycota）可能是提高紫花苜蓿对Cd抗性的关键根际微生物区系。
以往的研究表明，许多微生物类群，即Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi(如Acidobacteria(GP1、GP3和GP6)、Rhizobiales、Burkholderiales、Pseudomonadales和Frankineae)可以帮助植物吸收养分，提高植物生产力。例如，S.meliloti可以诱导根瘤菌占据豆科植物的结节，以帮助养分吸收。有研究表明，根瘤菌也可能提供病害保护，在提供养分的根瘤菌占主导地位的根三叶植物的微生物组，被细菌属富集。一项研究表明，根瘤菌也可能提供疾病保护，在三叶草属的微生物组中，提供养分的根瘤菌占主导地位，这些微生物群由细菌属富集。此外，已知许多细菌可以缓解铁(Fe)、磷(P)、镁(Mg)和钙(Ca)的缺乏，从而防止它们因重金属竞争而转移到植物根部。这些过程还可以通过增加根际中微量元素的利用率来促进紫花苜蓿的生长。因此，提高紫花苜蓿对Cd胁迫抗性的关键细菌类群的主要过程可能是它们为紫花苜蓿提供了吸收根际营养物质并减少植物光合作用衍生的碳（C）释放到土壤中的辅助作用（图5）。
与细菌群落相反，VPA显示真菌群落对土壤变量的影响较小(图4A和B)，这与我们的结果一致，即除Olsen-P和pH值外，真菌群落与根际中的SOC和养分没有很强的相关性(图4C)。我们的结果表明，真菌群落在提高紫花苜蓿抗Cd胁迫方面的相关效果低于细菌群落。这些结果也被发现的关键真菌类群和根际变量之间的微弱相关性所支持（图4E）。但是，由AMF接种引起的这些关键真菌类群的变化强烈影响了关键细菌类群，这表明这些关键真菌类群可能通过影响细菌群落的方式在Cd胁迫下辅助苜蓿生长中发挥间接作用。这些结果也阐明了根瘤菌和AMF共同接种与单独接种相比促进苜蓿抗性和生长的原因。通过PLS-PM分析（图5），关键的真菌类群对关键的细菌类群有直接影响，这对植物的抗性和生长有间接的有利影响。一般来说，在根瘤菌和AMF共同接种处理下，根瘤菌群落而非相应的真菌群落主要提高了紫花苜蓿对Cd胁迫的抗性。
结 论
对共生微生物如何影响根际微生物类群以协助苜蓿抵御Cd胁迫提供了新的认识，根际群落成员间的相互作用或接种后群落组合的动态是重要因素。与单一接种相比，根瘤菌和AMF联合接种对苜蓿抗Cd胁迫的综合效应最大。根瘤菌和AMF共接种对主要细菌类群产生强烈影响，主要通过帮助植物从根际吸收养分和减少植物光合作用产生的C分配到土壤中来提高苜蓿对Cd胁迫的抗性。这些研究结果对进一步提高植物的抗逆性，保证牧草和作物的生产具有重要意义。
