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什么是微生物菌种的衰退

放大字体  缩小字体 发布日期:2015-06-27  浏览次数:213
核心提示:⒈ 菌种衰退的原因菌种衰退的原因有两个方面:一是菌种保藏不妥;二是菌种生长的条件要求没有得到满足,或是遇到不利的条件,或
⒈ 菌种衰退的原因
菌种衰退的原因有两个方面:一是菌种保藏不妥;二是菌种生长的条件要求没有得到满足,或是遇到不利的条件,或是失去某些需要的条件。此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变,从而丧失新的特征等情况。
菌种的衰退会使微生物个体和群体特征的各个方面发生变化,其中最重要的是使所需产物的生产产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件的性能减弱等。菌种的退化不同于培养过程中由环境条件变化引起的表面的、暂时的变化,而是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株衰退的一个从量变到质变的遗传变异过程。
菌种连续传代是菌种发生衰退的直接原因。由于连续传代使菌种经常处于旺盛的生长状态,且每次传代时营养和环境等培养条件都是在不断地变化,与处于休眠状态的菌种相比,细胞的自发突变率要高得多。因此,菌株经过连续传代后,含突变基因的个体在数量上逐渐占优势,退化现象就逐渐显露出来。培养基灭菌升、降温的不同,培养基存放时间的不同,采用老龄菌和多核菌丝传代等都比较容易引起菌种衰退。
菌种的保藏主要是通过控制低温、干燥、缺氧等条件,使微生物营养体或休眠体处于不活泼的状态,维持最低代谢水平,尽可能保证活力和不发生变异。但是,各种菌种的保藏法对阻止菌种变异的效果不尽相同,用效果较差的条件保藏菌种时,菌种就较易发生衰退。此外,保藏操作不当也会影响保藏效果,甚至导致菌种的变异。
菌种自身突变引起菌种衰退。菌种的自发突变和回复突变是引起菌种自身衰退的主要原因。微生物细胞在每一世代中的突变概率一般为10-8~10-9,保藏在0~4 ℃时这一突变概率更小,但仍然不能排除菌种衰退的可能。诸如对营养缺陷型菌种未充足供给所需营养物,菌种就会发生突变而丧失已有的特性。
菌种的回复突变是指突变菌株因遗传组成的自身修复,使原有的遗传障碍解除,代谢途径发生变化,从而恢复原有的特性,表现出原育种过程中已获得的优良性状的退化。
突变不完全造成菌体遗传组成的差异。对于单核细胞的菌株,菌体内的DNA双链中仅有一条链发生位点突变,并复制成变异菌的DNA链,而未发生变化的一条链,复制成原菌的DNA链,结果形成不纯的菌落,经移植后表现出菌种的衰退现象。同样,对于具有两个核以上细胞的菌株,如果只有一个或几个核发生变异,将会产生异核菌丝,不纯的异核菌丝分裂,便会形成性状不同的菌丝,而一旦性状不同的菌丝占优势,就将表现出菌株的衰退,而不再具有优良的性状。
如果菌落不是由一个孢子或一个细胞形成,当其中只有一个高产突变的孢子或细胞,通过移植后,高产菌株数量就比较少,表现出菌种衰退。
⒉ 菌种性能的改变
⑴ 菌种遗传特性的改变 从菌种遗传机理这一微观角度来看,菌种遗传特性的改变主要有如下三个原因。
① 异核现象导致微生物群体发生变异。某些菌丝生长时会和邻近的菌丝细胞间发生吻合,形成异核菌丝体(简称异核体),即在一条菌丝里含有几个遗传特性不同的细胞核,共同生活在均一的细胞质里。异核体可以由遗传性不同的菌丝吻合后形成,也可由多核菌丝中个别核发生突变而产生。异核体所产生的单核或多核的孢子具有不同的遗传特性和不同的生长繁殖速度,其结果是伴随着菌种传代培养,菌种的遗传特性发生改变。在菌种选育过程中,许多从培养基中新分离出来的丝状菌是异核体。在抗生素生产中,从产生单核分生孢子的异核体进行单孢子自然分离,可以得到同核的单菌落,其中很多表现出稳定的生产能力。
② 自发突变导致菌种遗传特性改变。由于DNA在复制过程中会出现偶然的差错,以及环境中某些物质和某些微生物自身的代谢产物对微生物有刺激作用,菌种以很低的频率发生自发突变。
③ 突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种往往不稳定,容易发生回复突变或产生分离子,以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型(亦称遗传型)的个体。
以上是导致菌种变异的遗传因素,这些因素将通过环境得以表现。生产菌种在使用过程中,需要在人工培养条件下进行传代,虽然原始斜面菌种是由单菌落发育而来,但菌落上的许多分生孢子已经具有不同的遗传基础,所以菌种的性状实际上是孢子群体的特征。较纯的群体,传代后变异较少;不纯的群体,传代后变异较多。在菌种传代培养过程中,导致菌种遗传特性改变的以上几个原因都可起作用,其结果使群体中变异菌株增多。传代培养还具有某种选择作用。通常所说的菌种优良性状和大量生成目的产物的有关的高产菌株往往表现出生活力弱、生长繁殖速度慢的特点。这些特点使得传代培养实质上具有富集低产菌株的作用。所以,菌种传代次数过多会导致菌种衰退。此外,菌种保藏条件不当也会使菌种发生变异。在菌种保藏过程中采用的一些手段,例如冷冻干燥,会对菌体细胞的结构和DNA造成损伤,在修复这些损伤时,菌体就可能发生变异。
⑵ 菌种生理状况的改变 菌种的遗传特性需要在一定条件下才能表现出来。由于培养条件不适当,使菌种处于不利于发酵生产的生理状况,其结果也表现为菌种衰退。菌种处于不利于发酵的生理状况有以下三个方面的原因。
① 一个菌种不是纯的群体,而是由一些变异株混合组成,这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。一个由单菌落发育而来的菌种在固体培养基上分离,可以长出许多种形态培养特征的菌落。这些不同的菌落类型在代谢和生长繁殖速度等方面有一定差异。培养条件可以影响各变异株在培养物中的比例而改变该菌种的特性。同一个菌种的单孢子分离在不同的培养基上,所生长出的单菌落,其形态培养特征有显著差异,各种类型菌落所占的比例也不同。如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)在豌豆琼脂培养基上,单孢子分离呈现出3~4种菌落类型,而在黄豆粉培养基上仅出现两种菌落类型。在开始菌种选育工作时,要研究单菌落的分离培养基,找出能呈现较多菌落类型的分离培养基。菌落类型和发酵产量之间存在着某种程度的相关性。在选种实践中,人们经过对菌落形态的考察,有意识地丢弃一些被认为是低产的菌落,挑选那些可能是高产的菌落。
② 菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成,因而影响发酵。菌种培养基营养贫乏也同样不利于发酵。因为菌种在营养贫乏的培养基中多次传代,会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰老甚至死亡。因此,自然选育或菌种培养所用的培养基应选择具有菌种传代后生产能力下降不明显、菌体不易衰老和自溶的正常形态菌落、孢子丰富的培养基。
③ 在某些培养条件下,菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态,而使菌种的生理状态改变。这种改变可能以类似于生理性迟延或细胞分化的机制保持较长一段时间。
由于菌种的衰退将会引起发酵过程的产量急剧下降,一旦发生菌种衰退,就必须采取有效的预防和防治措施,防止菌种的优良性状发生退化。同时若发现某些优良性状退化,应及时进行分离纯化,使生产菌种保持稳定的优良特性。防止菌种衰退的措施主要有菌种的复壮、提供良好的环境条件、定期纯化菌种、防止自身突变等各个方面。
⒊ 防止菌种衰退的措施
要防止菌种衰退,应该作好保藏工作,使菌种优良的特性得以保存,尽量减少传代次数。如果菌种已经发生退化,产量下降,则要进行分离复壮。
⑴ 菌种的分离 菌种发生衰退的同时,并不是所有的菌种都衰退,其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的、具有更强生命力的菌体。因此,采用单细胞菌株分离的措施,即用稀释平板法或用平板划线法,以取得单细胞所长成的菌落,再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定,就可获得具有原来性状的菌株,甚至性能更好的菌株。如对芽孢杆菌,可先将菌液用沸水处理几分钟,再用平板进行分离,从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。如果遇到某些菌株即使进行单细胞分离仍不能达到复壮的效果,则可改变培养条件,达到复壮的目的。如AT3.942栖土曲霉的产孢子能力下降,可适当提高培养温度,恢复其能力。同时通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。
菌种分离方法如下:
① 配合一定的培养条件,对退化菌株进行单菌落或单细胞分离,淘汰退化的个体,保留纯化菌种。
② 将芽孢杆菌的悬液加热至90 ℃处理数分钟,杀灭已退化的菌体,保留芽孢;再将芽孢或孢子进行传代,以淘汰退化的个体。
③ 提供特殊的培养条件,使环境有利于优良性状菌株的生长而不利于退化菌株的生长,从而淘汰已退化的菌株个体。
④ 将分离后得到的初筛菌株先保藏,再进行复筛考察,从中选出稳定性较好的菌种。
⑤ 同时应用上述方法中的两种或两种以上的方法,会收到更好的复壮效果。
⑵ 菌种的复壮 菌种的复壮有狭义的复壮和广义的复壮。狭义的复壮指的是菌种已经发生衰退后,再通过纯种分离和性能测定等方法,从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体,以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。而广义的复壮应该是一种积极的措施,即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作,使菌种的生产性能逐步提高,所以,这实际上是一种利用自发突变(正突变)从生产中不断进行选种的工作。
⑶ 提供良好的环境条件 进行合理的传代,减少传代次数可防止由于菌种的遗传稳定性变化而引起的自发突变,以及由于环境条件变化导致的退化。菌种允许使用的传代次数必须通过传代的稳定性试验确定。发酵生产上一般只用三代内的菌种。采用合适的传代条件使培养条件有利于高产菌的生长,而不利于低产菌的生长,减少突变的发生。
⑷ 用优良的保藏方法 尽可能采用诸如斜面冰箱保藏法、砂土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法以及采用干孢子保藏等优越的保藏方法保藏菌种,以防止菌种的衰退。
⑸ 定期纯化菌种 对菌种进行定期的分离纯化,可减少其中共存的自发突变菌或“突变不完全”产生的退休型菌株的增殖机会,保持原来的优良特性。诸如对营养缺陷型菌种在纯化过程中提供足够的营养物,以保持菌株的优势,避免回复突变体的竞争。同样在进行抗性突变的菌种纯化时在培养基中加入对应于抗性的药物,可保持菌株的抗性优势,避免产生无抗性的回复突变体。
采用遗传性稳定的菌体作为菌种、合适的培养基传代等可减少和防止菌种的自身突变。  
 
 
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