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改造Surfactin分子结构的组合生物合成技术

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-12-09  浏览次数:159
核心提示:改造Surfactin分子结构的组合生物合成技术

3 改造Surfactin分子结构的组合生物合成技术

组合生物合成技术(combinatorial biosynthesis),即通过基因工程技术,有目的地改变天然产物的生物合成途径,形成可预测的新结构产物。组合生物合成技术在环脂肽类抗生素结构改造中发挥了重要作用,这些人为产生的新结构化合物按照研究者的预期表现出新的功能或活性。

3.1 合成具有不同肽环模块的surfactin新结构分子

非核糖体肽合酶的组合生物合成研究策略包括模块定点突变、替换、插入、删除、模块“洗牌”等。Koglin等通过对surfactin合成酶系NRPS蛋白晶体结构的解析及分子模拟的研究,逐渐阐明了各个功能模块存在选择特异性的原因。经过大量的序列比对和同源建模分析,研究者总结出决定腺苷结构域(A domain)底物选择性的“密码子”——10个氨基酸残基,为定点突变提供了经验指导,这样就可以将NRPS特定位置的氨基酸突变为其他氨基酸。例如:通过定点突变技术,将模块C-AGlu-PCP中的Lys239突变为Gln239;生化分析和发酵产物显示,该模块腺苷结构域的识别氨基酸由Glu变为Gln;此外,识别Asp的腺苷结构域也可以突变成识别Asn,由此策略,研究者获得了数个surfactin的结构类似物。还有研究学者通过对NRPS的改造,使得模块能对带有特别功能团的非天然氨基酸进行识别和活化。如针对识别苯丙氨酸的腺苷化结构域的突变和改造,使得识别底物拓展为带有叠氮或炔烃官能团的非天然芳香族氨基酸,从而使得以叠氮-炔基Husigen环加成反应为代表的“点击化学”(click chemistry)极大地丰富了肽模块的多样性。

通过基因工程的手段将目标腺苷结构域进行无义突变,这样合成的肽链上就缺失了特定氨基酸。比如,在保证读码框不变的情况下,研究者将surfactin基因簇模块2缺失,获得一个相应位置Leu缺失的缩环产物,即六肽surfactin新分子。六肽surfactin对红细胞的毒性降低,抑菌能力增强;但由于自身结构的不稳定等原因导致了六肽surfactin产量只有野生菌株的5%–10%,发酵浓度仅25–50 mg/L。NRPS的模块删除还可以做到极致,即仅保留谷氨酸作为亲水基团,形成产物为β-羟基脂酰谷氨酸(FA-Glu),已有的研究表明,新化合物FA-Glu较商业化表面活性剂肉豆蔻酰谷氨酸具有更低的临界胶束浓度(CMC)和更高的水溶性。但是FA-Glu的产量仍较低,是野生型菌株surfactin产量的15%左右,发酵浓度仅200–250 mg/L[29]。Jiang等[30]用温敏型质粒分别敲除了B. subtilis PB2-L1中的产surfactin的NRPS模块SrfAA-Leu、SrfAB-Asp和SrfAB-Leu,结果产生了3种六肽结构的surfactin新化合物,分别缺少Leu-3、Asp-5和Leu-6;与原来的surfactin相比,前两者可以减少毒性,后者具有更强的抗真菌活性,但新结构surfactin产物的积累浓度极低,只有0.82–1.35 mg/L。

组合生物合成技术在开发surfactin新结构及拓展其应用方面,既存在机遇也存在挑战。改造NRPS区域可以产生具有新活性的新型结构分子,但是NRPS结构复杂性远远超出人们的想象,模块的完整性、链接区多样化导致了人们的实际操作过程并不理想。通过基因改造策略实现生物合成基因簇突变后,经常不生产结构类似物,或者改造过的NRPS催化效率大大降低、产量大大减少。

3.2 Surfactin中脂酰基结构的改造

相比于已经深入研究的NRPS催化surfactin肽环结构的合成,surfactin分子中脂酰基结构的合成途径研究则显得很单薄。Surfactin中脂肪链的长度一般为C13–C15,通常以C14和C15组分为主(60%–80%),脂肪酸组分的结构差异也会对物理化学性质和生物活性产生显著的影响。在抗真菌活性和表面活性方面,构型性能为straight(n)强于iso强于anteiso;在发泡能力方面C14-surfactin强于C13和C15。随着surfactin脂肪链长度的增加,其表界面活性显著增强。甚至,surfactin脂肪酸组分比surfactin总产量对表面活性的影响作用更大,iso-奇数脂肪酸异构体比n-偶数脂肪酸异构体具有更高的排油圈活力。本课题组的研究表明surfactin在同等工作浓度下,C15-surfactin组分含量越高,其油砂清洗效率和原油驱替效率越高。因此,在对surfactin的结构多样性研究中,定向改造或强化特定碳链组分的surfactin产物对于促进surfactin的应用同样具有重要意义。

糖脂类生物表面活性剂如鼠李糖脂或槐糖脂,其疏水结构也都是中长链的脂肪酸;糖脂的疏水结构脂酰基链长及不饱和度与菌株特性有关,也与发酵原料有关,糖脂的优势发酵底物通常是油脂或脂肪酸。但是,向培养基中添加油脂或游离脂肪酸并不能促进surfactin合成,反而起抑制作用,这也使得我们推测surfactin中的脂肪酸结构可能来源于从头合成途径。

有关surfactin脂肪酸结构的早期研究是通过改变培养基中氨基酸组分来实现,如在B. subtilis T89-42菌株的培养基中添加Arg、Gln或Val可以增加偶数β-羟基脂肪酸组分(C14, C16),而添加Cys、His、Ile、Leu、Met、Ser或Thr可以增加奇数β-羟基脂肪酸组分(C13, C15)。此后,人们通过改造或强化某些氨基酸合成途径,也引起了surfactin产物的脂肪酸组分变化。Coutte等通过强化L-Leu的代谢途径,使得B. subtilis 168衍生菌株中surfactin产量提高了1.6–20.9倍;其中,敲除codY基因以后,不仅让surfactin的产量达到最高,还使得surfactin的结构组分发生了变化:对照菌株中C13和C14的组分分别是39.7%和21.2%,而敲除了codY以后的比例分别为26.5%和40.6%。后来,Coutte等在研究支链氨基酸代谢途径时发现,在敲除了负责支链氨基酸最后一步降解的基因lpdV后,带有直链C14的surfactin比例提高了2.5倍。

显然,利用外源添加氨基酸组分或内部改造氨基酸合成途径还难以实现对surfactin脂肪酸结构的定向控制;针对脂肪酸结构的改造,还需要深入理解surfactin的底物3-羟基脂肪酸如何参与NRPS的合成启动。Steller等的研究表明,在surfactin的合成起始步骤中,底物3-羟基脂肪酸在脂酰CoA连接酶(fatty acyl CoA ligases,FACLs)作用下与辅酶A (CoA)结合后,以3-羟基脂酰CoA的激活形式参与第一个氨基酸Glu的酰化作用。他们对枯草芽胞杆菌中4个FACLs (LcfA、YhfL、YhfT和Yngl)进行敲除实验发现,单一敲除只能导致surfactin的产量降低38%–55%,同时敲除2–3个基因时surfactin产量约为20%–65%,同时敲除4个基因时产量下降了84%。这一结果表明surfactin合成途径中,催化脂肪酸形成脂酰CoA激活形式的FACLs可能存在多个基因或多个同工酶。

NRPS的合成起始模块srfA-A1的C domain对底物脂肪酰CoA的选择性对于surfactin合成的起始更为重要。Kraas等[40]采用3-羟基肉豆蔻脂酰CoA、棕榈脂酰CoA、癸脂酰CoA、3-羟基丁脂酰CoA为surfactin合成起始模块的供体,结果表明C domain选择3-羟基肉豆蔻酰CoA为底物进行酰化反应,不催化没有羟基化的脂肪酰CoA进行酰化反应。这一结果表明NRPS合成起始模块srfA-A1的C domain有可能成为脂肪酰结构改造的重要靶标,通过解析合成起始模块srfA-A1中C domain的底物选择性机制,就有可能进一步通过突变来获得能催化特殊结构脂酰基底物的起始模块。

总之,相比已经深入研究的NRPS催化的surfactin肽环结构,其脂肪酸结构组分的合成及调控机制还存在很多未知区域;获得特定脂酰基结构的surfactin新化合物仍然没有很好的解决方案。我们推测通过强化脂肪酸的从头合成途径,改造脂酰CoA连接酶FACLs和合成起始模块C domain的底物选择性,有望创造或强化特定脂酰结构的surfactin组分。

 
 
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