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衣原体特异性抗原和抗体检测方法

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-01-09  浏览次数:144
核心提示:衣原体特异性抗原和抗体检测方法
1、材料 
①7—8d日龄的鸡胚,McCoY细胞或HL细胞。 
②荧光显微镜,CO2孵箱。 
③沙眼衣原体免疫荧光诊断试剂盒,吉姆萨染色液。 
2、方法 
(1)标本采集 
①沙眼病人眼结膜标本的采集。在10%丁卡因局部麻醉下,用无菌狭长盖玻片(0.5*2cm)刮取眼结膜上的滤泡组织,置于盛有1—2ml蔗糖磷酸盐缓冲液的小玻璃瓶内,-4—20℃冰箱 内保存。 
②男性尿道炎标本的采集。用无菌特制的尿道拭子伸入尿道口内2—4cm,旋转数次,抽出置于保存液中。 
③女性宫颈炎标本的采集。用无菌窥阴器张开阴道口,以无菌特制的宫颈拭子深入宫颈2—3cm2,旋转数次抽出放人保存液中。分离培养时,从低温冰箱取出,加入链霉素200U、万古霉索,在4℃冰箱中处理过夜备用;也可在保存液中预先加入庆大霉素、两性霉素。 
(2)鸡胚分离培养取7—8d日龄的鸡胚,用8号针头吸上述标本接种卵黄囊0.25ml,35℃温箱培养,逐日观察,将2d后死亡及9d后仍存活者予以解剖。收集卵黄囊膜并制成涂片,吉姆萨染色后油镜观察,如在涂片中找到紫红色颗粒者为阳性。如活体解剖者,可盲目传1—2代。如仍找不到细颗粒EB(原体)者为阴性。 
(3)细胞分离培养:可选用McCoy、HEla-229、FL、HL等对衣原体敏感的长成单层的细胞,载体可用玻璃小瓶或塑料培养板,在底部可预置适当大小的盖玻片。接种标本后,1800—3000g离心1h,促进EB进入细胞。吸附1h,吸去上清液,加入含放线菌酮0.5ug的1640维持液, 35℃CO2孵箱或密封培养,48—72h后取出盖玻片,漂洗、甲醇固定后,可作吉姆萨、碘液或单克隆抗体荧光抗体染色,高倍显微镜或荧光显微镜下观察包含体。必要时,亦可作盲目传1—3代。 
    细胞培养法的敏感性为80%—90%,特异性为100%,是目前诊断沙眼衣原体感染最可靠的方法,因此是评价其他实验室诊断方法的金标准。 
① 涂片检测:包括结膜涂片和宫颈拭子涂片,前者可用吉姆萨染色或单克隆抗体荧光抗体染色,寻找包含体;后者可用单克隆抗体荧光抗体染色寻找涂片中的RB(始体)或EB颗粒。此法敏感性较低,与细胞培养法比较,敏感性仅为70%—80%,特异性为80%。但此法在于简便易行。约需20min,但需有高质量的单克隆抗体和荧光显微镜,且观察人员必须有丰富的经验。 
② ELISA检测衣原体抗原此法应用的主要是结膜刮片、尿道和宫颈拭子,时间需2—3h。一般报告其敏感性为62%—98%,特异性为92%—98%。有经验的实验室人员,诊断泌尿生殖道衣原体感染时,其敏感性为细胞培养的70%—80%。但经不断改进后的多家公司生产的诊断试剂,其敏感性已提高到85%—90%。 
③ 快速诊断试剂:最近出现了一些快速诊断试剂,例如美国加利福尼亚州新传生物技术公司生产的CHLAMYGEN衣原体快速诊断试剂盒是一种酶反应检测系统,含有一合成底物,预置于特制的拭子上。用此拭子采集尿道或官颈的上皮细胞,滴加所附试剂A和B各2滴于拭子上,等待10min,再滴加2滴试剂C,1min内出现紫色者为阳性。全过程只需12min,确实快速 。与细胞培养法相比,其敏感性为97.2%,特异性为99.2%。但一些专家认为,目前的一些快速诊断试剂,还都存在着敏感性和特异性方面的问题。 
(4)检测特异性抗体———微量免疫荧光检测法:Wang等创建的微量免疫荧光(MIF)技术,是检测衣原体抗体较好的方法。此项技术可作分离物的血清学分型,也可严格应用于血清流行病学的研究。它可给人们提供多方面有用的资料:临床致病谱和感染的后果,在不同人群中流行病学的分布。这是一种主观性较强的试验,因此观察者需要有丰富的实践经验。一般认为此法不适用于诊断衣原体的早期感染,且敏感性和特异性均不高。然此法作为流行病学调查,颇为简便。 
    用此法测定的型抗原是位于衣原体表面的表面抗原。可用强碱处理(pH12.5,37℃,1h),溶解于氯仿一 甲醇一水中,分层提取脂类 。该型抗原不会被1%胰酶、链霉蛋白酶或过碘酸盐所破坏,是与蛋白质结合的类脂半抗原。微量免疫荧光技术把沙眼衣原体共分为15个血清型:即A、B、Bb 、C、D、E、F、G、H、I、J、K和L1、L2、L3,前12型称为沙眼包含体结膜炎衣原体,后3型为淋巴肉芽肿衣原体。
 
 
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