1.原理
利用营养琼脂培养基对样品中枯草芽孢杆菌活菌数计数,利用MRS培养基对样品进行乳酸菌总数计数,再利用LBS培养基选择性培养计数植物乳杆菌活菌数,用乳酸菌总数减去植物乳杆菌活菌数即为戊糖片球菌活菌数。
2.培养基和稀释液
按本标准规定的方法配制或购买商品化的产品。
除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的二级水或相当纯度的水。
2.1 MRS培养基
2.1.1 成分
蛋白胨 10g;肉膏 10g;酵母提取物 5g;K2HPO4 2g;柠檬酸三铵 2g;乙酸钠 5g;葡萄糖20g;Tween80 1mL;MgSO47H2O 0.58g;MnSO4H2O 0.25g;琼脂 15g。
2.1.2 制法
将上述成分完全溶解于1000mL蒸馏水内,调pH6.2-6.4, 121℃ 灭菌15min。
2.2 LBS培养基
2.2.1 成分
酵母浸粉 5.0g;胰蛋白胨 10.0g;磷酸氢二钾 6.0g;硫酸亚铁 0.034g;硫酸镁 0.575g;葡萄糖 20.0g;乙酸钠 25.0g;柠檬酸钠 2.0g;硫酸锰 15.0g;吐温-80 1mL;冰乙酸 1.3mL。
2.2.2 制法
称取(吸取)以上各成分,加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中,当日使用,无需高压灭菌。次日使用,需118℃高压灭菌15分钟。
2.3 营养琼脂培养基
2.3.1 成分
蛋白胨 10g;牛肉膏 3g;氯化钠 5g;琼脂 15g。
2.3.2 制法
将上述成分完全溶解于1000mL蒸馏水内,调pH7.3±0.2。 121℃ 灭菌30min。
2.4 麦康凯培养基
2.4.1 成分
蛋白胨 20g;乳糖 10g;牛胆盐 5g;氯化钠 5g;琼脂 17g;0.5%中性红水溶液5ml;0.01%结晶紫水溶液10ml;蒸馏水 1000mL。
2.4.2 制法
麦康凯培养基:将上述成分完全溶解于1000mL蒸馏水内,调Ph7.1-7.3, 121℃ 灭菌15min。
2.5 稀释液
2.5.1 成分
氯化钠 8.5g;蒸馏水 1000mL。
2.5.2 制法
准确称量氯化钠8.5g,置于1000mL容量瓶中,用蒸馏水定容至1000mL后, 121℃灭菌15min。
3. 仪器与设备
3.1 天平:感量:0.01g。
3.2 震荡器。
3.3 高压灭菌器:≥121℃。
3.4 生化培养箱:厌氧培养的,具相应的功能。
4. 样品制备
按GB/T 14699.1的规定,采取有代表性的饲料样品500 g,按四分法制备试样。
5.测定步骤
5.1 样品稀释
准确称取待测样品10g,放入装有90mL稀释液并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中备用。将三角瓶在旋转式摇床上200r/min充分振荡20min,即成10-1稀释液;再用1mL无菌吸管,吸取10-1稀释液1mL移入装有9mL稀释液的试管中,充分混匀即成10-2稀释液;再换一支无菌吸管吸取10-2菌液1mL移入装有9mL稀释液试管中,即成10-3稀释液;以此类推,连续稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等一系列稀释度菌液,供平板涂布用。
5.2 涂布
用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL,分别加至培养基平皿表面,用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂于琼脂表面。JYE01样品取10-7、10-8和10-9三个稀释梯度,JYE02样品取10-8、10-9和10-10三个稀释梯度,JYE03样品取10-8、10-9和10-10三个稀释梯度,JYE04样品取10-8、10-9和10-10三个稀释梯度,每一稀释度重复两次,同时用稀释液作为空白对照。
5.3 培养
将接种好的培养皿倒置于生化培养箱内,植物乳杆菌、戊糖片球菌于37±0.5℃培养48～72h,枯草芽孢杆菌于37±0.5℃培养16～24h。
5.4 菌落特征
5.4.1 植物乳杆菌菌落特征
菌落中等大小,微白色,湿润,边缘不整齐,直径1-3mm,可有淡淡的晕。
5.4.2 戊糖片球菌菌落特征
菌落较小,圆形,直径1.0-2.5mm,乳白色,边缘整齐,可有淡淡的晕。
5.4.3 枯草芽孢杆菌菌落特征
菌落为扁平、边缘不整齐、表面粗糙皱褶,污白或微黄色。
5.5 菌落计数
5.5.1 计算公式
枯草芽孢杆菌活菌数(CFU/g)=枯草芽孢杆菌菌落平均数×稀释倍数×10
植物乳杆菌活菌数(CFU/g)=植物乳杆菌菌落平均数×稀释倍数×10
乳酸菌总数(CFU/g)=MRS培养基上菌落平均数×稀释倍数×10
戊糖片球菌活菌数(CFU/g)=乳酸菌总数-植物乳杆菌活菌数
5.5.2 菌落计数办法
只计算A.5.4(特征)的菌落。
当只有一个稀释度,其菌落数在30～300之间时,则以该菌落数乘以稀释倍数。
若有两个稀释度,其菌落数均在30～300之间,应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2,计算两者的平均数乘以稀释倍数;若大于2则计数其中较小的菌落数乘以稀释倍数。
若三个稀释度的菌落数均大于300,则应按稀释度最高的菌落数乘以稀释倍数。
若三个稀释梯度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的菌落数乘以稀释倍数。
结果表示:每克样品中的有效活菌数,单位为CFU/g,保留两位有效数字。
6.杂菌率
6.1 杂菌计数
取稀释后10-5、10-6、10-7样品液0.1ml于麦康凯培养基上,充分涂布,待液体完全吸收后倒置于37℃培养箱中培养24小时。计数。
6.2 杂菌率计算公式
杂菌率(%)=(杂菌数/最高有效菌数)×100
